Laboratorní metody

Laboratorní postupy pro mimotělní oplodnění:

Další laboratorní postupy:

  • ICSI (intracytoplasmatická injekce spermie)
  • IMSI (intracytoplasmatická morfologicky selektovaná injekce spermie)
  • PICSI
  • AH (asistovaný hatching)
  • Prodloužená kultivace embryí
  • Kryokonzervace oocytů
  • Kryokonzervace embryí
  • Kryokonzervace spermií
  • PESA,TESA,MESA,TESE
  • PGS, PGD
    • CGH (comparative genomic hybridization)
    • Vyšetření monogenetických vad
    • Biopsie trofoektodermu
  • EmbryoScope
  • Dárcovství spermií
  • Dárcovství oocytů

Operační metody pro získání spermií z varlete či nadvarlete – PESA, TESA, MESA, TESE

Pionýrem prvního těhotenství na světě a narození zdravého dítěte po získání spermií operací z varlete se stal spolupracující vědecký pracovník center prof. Zecha a světově uznávaný klinický embryolog – Dr.Pierre Vanderzwalmen.

[Pregnancy after fertilisation with human testicular spermatozoa. Lancet (1993)].

TESE „Testicular Sperm - Extraction“, TESA = „Testicular Sperm - Aspiration“. Obě jsou to techniky pro získání spermií přímo z varlete. TESE je indikovaná, pokud se v ejakulátu vyskytují jen ojedinělé (OAT-Syndrom) nebo pokud spermie v ejakulátu chybějí-neobstrukční azoospermie. TESA (je méně invazivní, protože je prováděna perkutánní aspirací spermií- nejčastěji jen v lokální anestesii při obstrukcí chámovodů (obstrukční azoospermie).

PESA (percutaneuos epididimal spermaspiration) nebo MESA (microsurgical epididimal spermaspiration), představují menší chirurgické výkony pro získání spermií z nadvarlete a používají se při uzávěru chámovodů nebo při obstrukční azoospermii.
Po technikách TESE, TESA ale i PESA, MESA se vpichují spermie do cytoplasmy oocytu pomocí mikoroinjekčních technik (ICSI, IMSI). 

Ovum pick up (odběr oocytů)

Odběr oocytů je minimálně invazivní operační výkon, při kterém jsou u ženy v programu IVF punktována vajíčka z obou vaječníků. Výkon se provádí ambulantně, v analgosedaci (lehké anestezii) nebo krátké celkové anestesii pod ultrasonografickou kontrolou, přes zadní klenbu poševní. Trvá přibližně dvacet minut v závislosti na počtu ovariálních folikulů (dutinek ve vaječnících, obsahujících vajíčko). Počet ovariálních folikulů a získaných vajíček závisí na individuální reakci tkáně vaječníků. V embryologické laboratoři jsou vajíčka uložena do kultivačního systému, který zabezpečuje vhodné prostředí pro další vývoj.                       

Inseminace vajíček spermiemi

Po krátké době tzv. preinkubace (cca 2-6 hod) jsou vajíčka inseminována partnerovými spermiemi. Spermie prodělávají před inseminací přípravu, která spočívá v opakovaném proplachování a aktivním vycestování spermií do čistého roztoku. Takto oddělené nejkvalitnější spermie se přidávají do roztoku s vajíčky v množství cca 50.000 - 100.000 spermií na jedno vajíčko. K oplodnění dochází spontánně, spermie vlastním pohybem docestují k vajíčku a pronikají jeho obaly. Společná kultivace vajíček a spermií trvá 16-20 hodin. Po této době zjišťuje embryolog úspěšnost fertilizace (oplodnění), které je charakterizováno přítomností dvou prvojader v cytoplasmě. Oplodněná vajíčka ve většině případů (přes 95%) pokračují ve vývoji v embrya.

Kultivace vajíček a embryí

Oplodněná vajíčka jsou přenesena do čerstvého kultivačního roztoku a za dalších 24 hodin dochází k vývoji embryí, k dělení buněk (rýhování). Embrya jsou v tomto stádiu dvojbuněčná až čtyřbuněčná. Zvýšení úspěšnosti přináší prodloužená kultivace embryí. 

Embryotransfer

Embryotransfer představuje ambulantní výkon, při němž se embrya přenášejí do dělohy pacientky. Tenkou kanylou se aplikuje do dělohy jedno či dvě embrya. Počet přenášených embryí závisí na věku pacientky a počtu předchozích pokusů tak, aby byla optimální šance na úspěch a eliminovalo se riziko vícečetného těhotenství. Maximem však zůstávají 2 transferovaná embrya.

Celková úspěšnost léčby neplodnosti pomocí IVF/ICSI/IMSI se v Centru asistované reprodukce při GPK FN Plzeň stabilně pohybuje kolem 50% (pregnancy rate 50% na embryo transfer).

ICSI (intracytoplasmatická injekce spermie)

V případě snížené schopnosti fertilizace partnerovými spermiemi standardním IVF postupem (společnou kultivací spermií a vajíček), nabízíme použití mikromanipulační metody: intracytoplasmatické injekce spermie. Při tomto postupu je do každého vajíčka injekčně vpravena jediná spermie, s nejlepší pohyblivostí a vlastnostmi.

ICSI je vhodná především při mužské příčině neplodnosti (snížený počet spermií, zhoršená pohyblivost spermií, apod.), vždy při operativním získání spermií, u imunologických příčin neplodnosti, pokud dojde k selhání oplodnění při IVF, při opakovaných pokusech umělého oplodnění, při vyšším věku, při užití kryokonzervovaných spermií, při užití dárcovských spermií či vajíček a v některých dalších případech. Tato metoda má velmi vysokou úspěšnost.

V indikovaných případech lze metodu ICSI vylepšit ještě pomocí IMSI či PICSI (viz výše).

AH (asistovaný hatching)

Před nidací embrya v děloze musí embryo opustit ochranný obal, zonu pellucidu, který chránil vajíčko před vícečetným průnikem spermií. U některých žen může být tato zona pellucida silnější nebo pevnější a bránit embryu v jeho uvolnění, což může následně podporovat event. selhání implantace. V těchto případech, u žen nad 35 let, při zesílení zona pellucida a v případech opakovaného selhání implantace nabízí asistovaný hatching zvýšenou šanci na úspěch.

Asistovaný hatching je mikromanipulační výkon, který provádí embryolog na obalu embrya pomocí mikroskopu před přenosem embryí do dělohy. Jehlou nebo laserovým paprskem se vytvoří otvor v zoně pellucidě, který usnadní vycestování embrya.

Prodloužená kultivace embryí

Prodloužená kultivace je delší, minimálně o 24 hodin, nejlépe však až do stádia blastocysty (5-6-ti denní kultivace).

Prodloužená kultivace umožňuje transferovat nejkvalitnější embrya s největším potenciálem implantace. Současně pozdější transfer embrya se více přibližuje situaci přirozené, kdy se embryo dostává do dutiny děložní rovněž 5.-6. den po oplodnění. Sliznice je v této době na implantaci nejlépe připravena. Prodloužená kultivace zvyšuje pravděpodobnost otěhotnění.

EmbryoScope

Jedná se o unikátní přístroj spojující dokonalý inkubátor, kameru a počítač. Umožňuje semikontinuální sledování vývoje kultivovaných embryí bez nutnosti narušení optimálních kultivačních podmínek (teplota, CO2, pH).

Embryo je snímáno vždy v přibližně dvacetiminutových intervalech kamerou zabudovanou v inkubátoru. Jednotlivé obrázky jsou chronologicky řazeny počítačovým programem, který umožňuje získat tak časovou videosekvenci, která pak slouží embryologovi k určení dynamiky vývoje a k zachycení event. poruch dělení jednotlivých buněk embrya. Více těchto informací o vývoji embryí přináší lepší určení vývojového potenciálu embryí a tím umožňuje snížit počet transferovaných embryí bez snížení úspěšnosti celé léčby, ev. zvýšit úspěšnost léčby tam, kde doposud nebyla léčba úspěšná, ačkoliv kvalita získaných embryí byla vždy hodnocena jako dobrá. 

PGD/PGS - genetické vyšetření embryí před přenosem

PGD – preimplantační genetická diagnostika umožňuje vyloučení přítomnosti dědičných onemocnění embrya ještě před jeho zavedením do dělohy. Embrya s prokázanou dědičnou chorobou se netransferují. PGD umožňuje partnerům s genetickou zátěží vyloučit přenos závažných dědičných chorob na vlastní potomky.

PGS – preimplantační genetický screening je genetické vyšetření embryí, které slouží k vyloučení nově vznikajících chromozomálních anomálií (např. Downův syndrom).

Zavedení těchto metod v našem centru vycházelo z těsné spolupráce s objevitelem této metody prof.Yuri Verlinsky (laboratoř Chicago – USA)

V rámci PGD/PGS nabízí naše centrum jako jedno z mála v ČR metodu CGH – (comparative genomic hybridization), při které se vyšetřují všechny chromozomy vyšetřovanýich buněk embrya na event. aneuplodii či translokaci.

Rovněž jako jedno z mála center AR v ČR umožňujeme vyšetření embryí na konkrétní genetickou vadu v případě monogenetického onemocnění a jeho nosičství.

V poslední době naše laboratoř preferuje pro metody PGD/PGS techniku biopsie trofoektodermu blastocyst, která představuje nižší zátěž pro vyšetřované embryo a podstatné snížení rizika misdiagnozy z důvodu možného mozaisicmu embrya. 

Kryokonzervace embryí

Při zisku více kvalitních embryí, je možno „zbylá“ embrya kryokonzervovat (zamrazit) a ponechat pro pacientku k pozdějšímu transferu. V případě ovariálního hyperstimulačního syndromu či nevhodných podmínkách pro transfer (např. nízká sliznice děložní) apod. se zamrazují všechna embrya. Zamrazená embrya se uchovávají při teplotě –196 °C v tekutém dusíku. Po rozmrazení je obvykle více než 95% embryí vhodných k další kultivaci či transferu. Kryokonzervace spermií

Kryokonzervace spermií je méně technicky náročná a má delší historii, než kryokonzervace embryí. Vzhledem k vysokému počtu spermií v dávce ejakulátu a malému rozměru spermií je kryokonzervace spermií vysoce účinná a často používaná např. pro potřeby darování spermií nebo před plánovanou onkologickou léčbou.

Kryokonzervace oocytů

Další z možností kryokonzervace gamet buď pro budoucí použití (Program Ovita) nebo v případech, kdy muž není schopen aktuálně poskytnout své spermie v den odběru vajíček.